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Plant methods|关雪莹课题组报道了在植物中成功利用CUT&Tag进行染色质状态分析

编辑: 时间:2020-09-01 访问次数:565

基因表达调控在多细胞生物的生长和发育中起关键作用。在多细胞生物中,所有细胞都具有相同的基因组序列,但是,基因组调控,包括DNA甲基化、组蛋白修饰、转录因子及其募集的蛋白质复合物的差异结合,导致不同组织和不同发育时期的基因表达差异[1]。染色质免疫沉淀(Chromatin ImmunoprecipitationChIP)是一种广泛使用的染色质分析方法,可用于全基因组DNA-蛋白质相互作用的研究。然而,做过染色质免疫共沉淀(ChIP)的科研人员,常常遭遇过以下的烦恼:ChIP操作步骤繁琐,特别是样品一多,甲醛固定材料和超声打碎染色质的操作时间超长;准备了很久才收集够的材料,费劲心思完成ChIP反应,制备得到的DNA质检都达不到建库要求,只能重复再做,直到收集到足够的DNA,或者选择风险建库,得到一个低质量低重复性的文库;由于免疫沉淀过程中甲醛的交联和染色质的溶解,造成高背景信号和假阳性。2019年,由西雅图佛瑞德哈金森癌症研究中心开发的CUT&Tag Cleavage Under Targets and Tagmentation, CUT&Tag)技术,是一种研究表观基因组染色质分析策略的新技术[2]。 其作用与常规ChIP技术相同却有其独特的优势。与ChIP-seq相比,CUTTag技术具有更多优势,包括:(1)由于原位激活转座酶而产生的高分辨率和低背景信号; (2)不受ChIP中甲醛交联引起的表位掩盖(epitope masking的影响; (3)因为不需要材料的交联和DNA超声处理的步骤以及建库步骤,大大简化了操作流程,节省了实验时间(4)将转座体产生的片段与测序接头整合在一起,以进行PCR富集,不需要额外的建库步骤; (5)由于该过程的高灵敏度,因此需要少量的起始原料。


CUTTag ChIP-seq 流程比较图

CUTTag技术此前应用于动物细胞中。来自浙江大学农学院的关雪莹课题组团队,根据动物细胞中CUT&Tag的方法,发展了一套在植物中进行CUT&Tag的方法,为植物染色质状态的表观遗传研究提供了一个比ChIP更加优秀可行的方法。相关研究成果以“Efficient Chromatin Profiling of H3K4me3 Modification in Cotton Using CUT&Tag”为题发表在Plant Methods上。

 

由于细胞壁、大液泡和复杂次生代谢产物的存在,植物组织的ChIP技术应用仍然非常具有挑战性[5]。植物染色质的分离需要一种特定于植物的方法。例如,在染色质裂解之前需要分离出高质量的细胞核[5]。棉纤维是一种特殊的纤维素组织,单纤维为单细胞组织,同等重量的组织所含有的细胞核相对很低,活跃发育时期的棉纤维细胞含有大量的多糖,因此从中分离出足以进行ChIP反应的细胞核具有很大技术难度。在本研究中,以棉花为模型系统,为表观基因组研究开发有效的CUTTag方法。研究目标是(1)设置可在植物组织中广泛使用的CUTTag的详细步骤; (2)使用相同量的起始材料比较CUTTagChIP的信号分辨率; (3)提供有关多倍体植物中进行CUTTag数据分析的生物信息工作流程和总体信息。以H3K4me1组蛋白修饰为例子,本研究提供了一种使用植物细胞核分离的方式改进的CUTTag方法,并建立了适用于异源四倍体基因组的生物信息分析工作流程。本研究方法也可以广泛用于其他组织和植物。研究结果表明,与ChIP-seq相比,CUTTag方法比常规ChIP的实验流程更快,并且显示了更高的分辨率,更低的背景信号和更好的重复性。


CUTTag ChIP-seq 信号比较图

棉花植物(棉属)带有种皮毛(棉纤维),是全世界重要的商品。迄今为止,由于收获足够量染色质所需的起始原料数量,棉纤维中表观基因组修饰的概况分析仍很困难。棉纤维是单细胞结构,分化后,纤维细胞进入快速伸长阶段,使细胞长度增加至23 cm,而没有细胞分裂。这意味着在纤维细胞伸长阶段,细胞核不会增加。在延长阶段纤维的染色质富集需要大量的纤维组织,而效率相对较低。我们对可以从棉纤维中分离出的细胞核数量进行定量。从提取的DNA中,我们发现从四个20 D棉桃所产的棉纤维中提取的细胞核足以进行约20CUTTag反应。相比之下,根据我们的经验,每个ChIP反应至少需要20 µg染色质才能获得足够的DNA用于测序文库构建。因此,CUTTag仅需要常规ChIP策略所需原料的约1/20。此外,很少有染色质免疫共沉淀方法成功地用于研究在调节纤维分化和伸长中起关键作用的特定转录因子。我们建立的CUTTag为进一步研究棉纤维发育中的表观基因组学提供了一个有前途的策略。

该成果专门为植物细胞设计的优化的CUTTag方法具有广泛的植物表观遗传研究用途。在操作简单性和所需的实验时间方面,CUTTag优于传统染色质分析方法。 最重要的是,CUTTag需要更少的起始材料,并生成具有低背景噪声的高分辨率信号。


关雪莹教授,陶晓园博士,冯守礼博士,赵汀博士共同参与了此项研究,该研究项目得到了国家自然科学基金面上项目和青年项目,国家重点研发计划七大农作物育种专项(子任务),中国博士后基金,大北农基金,中央高校基本科研业务费,江苏省协同创新中心的支持。

 

文章发表连接

  https://plantmethods.biomedcentral.com/articles/10.1186/s13007-020-00664-8